Agrociência

Estabelecimento de uma ferramenta de biologia molecular para deteção de esporos de fungos presentes no ar

» aplicabilidade ao nível do setor agrícola para monitorização de fungos fitopatogénicos

〈 19/02/2021 〉

Os esporos de fungos constituem uma importante fração dos bioaerossóis presentes nos ambientes interiores e exteriores (Docampo et al. 2011; Nunes et al. 2008), estando muitas vezes associados a problemas de saúde pública por serem causadores de diversas patologias, de entre as quais se salienta a doença alérgica respiratória (rinite e asma).

Por outro lado, alguns dos fungos que compõem estes bioaerossóis são também causadores de doenças associadas a diversas culturas agrícolas (fungos fitopatogénicos), o que representa, em anos propícios ao seu desenvolvimento, avultados prejuízos para diversas fileiras do setor agrícola. Desta forma, a monitorização destes esporos de fungos presentes no ar atmosférico apresenta-se, para o setor agrícola, como uma ferramenta útil e de elevada importância. O conhecimento da sazonalidade dos esporos de fungos fitopatogénicos permitirá a elaboração de calendários de frequência e desenvolvimento de modelos de previsão que contribuirão para uma reação mais atempada, e consequentemente mais eficiente do ponto de vista da prevenção das doenças por eles causadas.

De entre as comunidades de fungos fitopatogénicos com impacto no setor agrícola destacam-se, por exemplo, as espécies pertencentes aos géneros Fusarium e Alternaria, causadores de fusariose e alternariose, em culturas de elevada importância económica como a amendoeira, o tomate, o milho e outros cereais.

A metodologia recomendada internacionalmente e correntemente utilizada na monitorização de esporos de fungos no ar atmosférico é a metodologia de Hirst (CENTS/TS 16868:2015; Gálan et al.2014, 2007; Caeiro et al. 2007), a mesma que é utilizada para a monitorização de grãos de pólen atmosféricos pela Rede Portuguesa de Aerobiologia (https://www.rpaerobiiologia.com). Esta metodologia baseia-se na utilização de um captador de bioaerossóis com sistema de Hirst, um Burkard 7-Day Volumetric Spore Trap (Figura 1).

Figura 1. Burkard 7-Day Volumetric Spore-trap®
do Centro de monitorização de Évora da Rede Portuguesa
de Aerobiologia (RPA-SPAIC).

O captador aspira o ar atmosférico com um fluxo de 10 L/min, ficando as partículas retidas numa fita de Melinex impregnada com uma solução adesiva. Esta fita de Melinex encontra-se fixa a um sistema rotativo que gira 2 mm/h, permitindo assim realizar contagens horárias e diárias. Associado a este método de amostragem, a identificação e quantificação dos esporos de fungos é realizada através de microscopia ótica, um procedimento moroso e dependente de técnicos com formação especializada. Esta morosidade é especialmente agravada para algumas espécies de fungos em que os esporos apresentam caraterísticas morfológicas que dificultam a sua identificação, nomeadamente as dimensões muito reduzidas, o facto de alguns deles não apresentarem coloração e a existência, em alguns casos, de uma heterogeneidade de formas (ilustrado na Figura 2).

Figura 2. Esporos de fungos dos géneros Alternaria spp. (A e B)
e de Fusarium spp. (C e D) observados ao microscópio ótico.

Neste contexto, o desenvolvimento de uma nova metodologia que possa funcionar como uma alternativa viável à técnica de Hirst, que permita obter resultados de forma mais rápida e expedita, apresenta obviamente um elevado interesse. Com este objetivo, investigadores do Instituto Mediterrâneo para a Agricultura, Ambiente e Desenvolvimento (MED) da Universidade de Évora, com conhecimento nas áreas da biologia molecular, fitopatologia e aerobiologia, delinearam uma estratégia focada na análise do material genético (ácido desoxirribonucleico – ADN) dos fungos fitopatogénicos de interesse. Para a realização deste trabalho foi essencial a colaboração da Rede Portuguesa de Aerobiologia – Sociedade Portuguesa de Alergologia e Imunologia Clínica (RPA-SPAIC), responsável pelos trabalhos de monitorização do conteúdo polínico dos bioaerossóis da atmosfera a nível Nacional e sua integração no boletim polínico (https:// www.rpaerobiologia.com/boletim-polinico).

Para identificação dos fungos de interesse, foi extraído o ADN das partículas biológicas retidas na fita de Melinex integrada no captador do Centro de monitorização de Évora (RPA-SPAIC), seguindo um protocolo previamente estabelecido no Laboratório de Biologia Molecular (MED).

Para deteção/quantificação dos fungos de interesse, o ADN extraído das partículas biológicas retidas na fita Milenex foi utilizado para amplificação de uma região específica, utilizando a técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) quantitativo em Tempo-Real (qPRC). Esta técnica de PCR em Tempo-Real baseia-se na deteção da fluorescência emitida ao longo do processo de qPRC, ou seja, ao longo dos ciclos estabelecidos no programa de amplificação. As amostras em que o ADN alvo exista em maior abundância, apresentam curvas de amplificação em que o crescimento exponencial se inicia primeiramente; ou seja, o ciclo de amplificação (Ct) é menor (Figura 3). A especificidade da técnica assenta na existência de três pontos de ligação às cadeias de ADN, as quais funcionam como molde na amplificação do fragmento de interesse – dois primers e uma sonda (ensaios Taqman). A sequência molde consiste numa região do ADN que existe em todos os fungos, sendo muito semelhante entre os fungos pertencentes ao mesmo género, o que garante a sua correta identificação.

Os ensaios Taqman específicos para os fungos do género Fusarium e Alternaria foram adaptados de protocolos previamente estabelecidos para deteção de fungos destes géneros em material vegetal (Campos et al. 2019; Pavón et al. 2011, 2012). Os resultados preliminares permitiram identificar os dois fungos nas amostras recolhidas, sendo claramente visíveis diferenças ao nível da sua abundância durante as 14 semanas consideradas no estudo (Figura 3). Estes resultados são promissores e indicam a possibilidade de utilizar no futuro esta metodologia na previsão dos níveis atmosféricos de esporos dos fungos fitopatogénicos Alternaria spp. e Fusarium spp.. Para que esta metodologia possa então ser colocada em prática e utilizada como uma ferramenta de diagnóstico para os fungos referidos, permitindo a elaboração de boletins fitossanitários, o próximo passo consistirá na realização de estudos que permitam estabelecer uma relação entre a quantidade de esporos no ar e o nível de patogenicidade nas diferentes culturas.

Agradecimentos: Os investigadores agradecem à Direção e à Coordenação do Grupo de interesse de Aerobiologia da Sociedade Portuguesa de Alergologia e Imunologia Clínica por permitir a utilização das amostras da Rede Portuguesa de Aerobiologia neste projeto de investigação do MED.

Autoria:
Maria Doroteia Campos1, Elsa Caeiro1,2, Maria do Rosário Felix3, Augusto Peixe3, Beatriz Tavares2,4, João Fonseca2,5,6,7, Manuel Branco Ferreira2,8,9, Hélia Cardoso1

1MED – Instituto Mediterrâneo para a Agricultura, Ambiente e Desenvolvimento, Instituto de Investigação e Formação Avançada (IIFA), Universidade de Évora, Polo da Mitra, Ap. 94, 7006-554 Évora, Portugal.

2SPAIC – Sociedade Portuguesa de Alergologia e Imunologia Clínica, Lisboa, Portugal.

3MED – MED, Escola de Ciência e Tecnologia (ECT), Departamento de Fitotecnia, Universidade de Évora, Polo da Mitra, Ap. 94, 7006-554 Évora, Portugal.

4Serviço de Imunoalergologia, Hospitais da Universidade de Coimbra, Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra, Coimbra

5Departamento Medicina da Comunidade, Informação e Decisão em Saúde – MEDCIDS, Faculdade de Medicina, Universidade do Porto, Porto

6Centro de Investigação em Tecnologias e Serviços de Saúde – CINTESIS, Porto

7Unidade de Alergia, Instituto & Hospital CUF Porto, Porto

8Clinica Universitária de Imunoalergolgoia – Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, Lisboa

9Serviço de Imunoalergologia, Centro Hospitalar e Universitário Lisboa Norte, Lisboa

Bibliografia:
Caeiro E, Brandão B, Carmo S, Lopes L, Morais-Almeida M, Gaspar Â, Ferraz de Oliveira J, Todo Bom A, Leitão T, Nunes C. (2007). Rede Portuguesa de Aerobiologia: Resultados da monitorização de pólen atmosférico (2002 2006). Rev Port Imunolaergologia 17 (3):235 250.

CENTS/TS 16868 (2015) Sampling and analysis of airborne pollen grains and fungal spores for allergy networks – Volumetric Hirst method. Documento tecnico UNI.

Campos MD, Patanita M, Campos C, Materatski P, Varanda CMR, Brito I, Félix MR (2019). Detection and quantification of Fusarium spp. (F. oxysporum, F. verticillioides, F. graminearum) and Magnaporthiopsis maydis in maize using Real-Time PCR targeting the ITS region. Agronomy, 9: 45. doi:10.3390/ agronomy9010045.

Docampo S, Mar-Trigo M, Recio M, Melgar M, García-Sánchez J, Cabezudo B (2011) Fungal spore content of the atmosphere of the Cave of Nerja (southern Spain): Diversity and origin. Sci Total Environ, 409: 835- 843.

Galán C, Cariñanos P, Alcázar P, Domínguez-Vilches E (2007) Spanish aerobiology network (REA): Management and quality manual. Servicio de publicaciones de la Universidad de Córdoba, Córdoba, Spain.

Galán C, Smith M, Thibaudon M, Frenguelli G, Oteros J, Gehrig R, Berger U, Clot B, Brandão R(2014) EAS QC working group. Pollen monitoring: minimum requirements and reproducibility of analysis. Aerobiologia., 30(4): 385-395.

Nunes C, Câmara I, Ferreira MB, Morais-Almeida N, Gaspar Â, Loureiro C, Falcão H, Todo-Bom A, Caeiro E, Brandão R (2008) Fungos na atmosfera de Portugal. Rev Port Imunoalergologia,16(4):377-394. Pavón MÁ, González I, Rojas M, Pegels N, Martín R, Garcia T (2011) PCR detection of Alternaria spp. in processed foods, based on the internal transcribed spacer genetic marker. Journal of Food Protection, 74 (2); 240–247. doi:10.4315/0362-028X.JFP-10-110

Pavón M Á, González I, Martín R, García Lacarra T (2012) ITS-based detection and quantification of Alternaria spp. in raw and processed vegetables by real-time quantitative PCR. Food Microbiology, 32(1): 165–171. https://doi.org/10.1016/j.fm.2012.05.006

Fontes das três primeiras imagens: https://www.seminis-us.com/resources/agronomic-spotlights/fusarium-rots-in-processing-tomatoes/ https://www.graincentral.com/cropping/prevention-is-better-than-cure-with-fusarium-head-blight/ https://agronomag.com/dangerous-corn-ear-rots-fusarium/

Artigo completo publicado na edição de fevereiro 2021.